BIU-87人膀胱癌細(xì)胞實驗操作步驟
BIU-87人膀胱癌細(xì)胞實驗操作步驟
細(xì)胞傳代與擴(kuò)增
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，需進(jìn)行傳代。棄去舊培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌2次以去除殘留血清。加入1-2 mL 0.25%含EDTA），37℃消化1-2分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓后，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。吹打制成單細(xì)胞懸液，按1:3至1:4比例分裝至新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)充適量培養(yǎng)基，輕輕搖晃使細(xì)胞分布均勻，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
凍存：取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化離心后棄上清，用預(yù)冷的凍存液（含90%血清+10%DMSO）重懸，分裝至凍存管（1-1.5 mL/管），標(biāo)注細(xì)胞類型、代次及日期。程序性降溫：4℃ 30分鐘→-20℃ 2小時→-80℃過夜，最后轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
復(fù)蘇：從液氮中迅速取出凍存管，37℃水浴震蕩至冰晶融化，酒精消毒后轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加5 mL培養(yǎng)基離心（1000 rpm, 5分鐘）。棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸，接種至培養(yǎng)瓶，24小時后更換培養(yǎng)基以去除DMSO殘留。
實驗干預(yù)與檢測
根據(jù)研究目的，可進(jìn)行藥物處理、基因轉(zhuǎn)染或siRNA干擾等操作。例如：
- 藥物處理：將配置好的藥液加入培養(yǎng)基，設(shè)置濃度梯度（如0 μM、5 μM、10 μM），每24小時觀察細(xì)胞形態(tài)并記錄。
- CCK-8檢測：接種細(xì)胞至96孔板（3000-5000細(xì)胞/孔），干預(yù)后每孔加10 μL CCK-8試劑，孵育2小時，用酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度，計算細(xì)胞存活率。
?數(shù)據(jù)整理與注意事項
- 每次實驗需設(shè)立3個復(fù)孔，數(shù)據(jù)取均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
- 嚴(yán)格無菌操作，定期檢測支原體污染。
- 細(xì)胞代數(shù)控制在10-15代以內(nèi)，避免遺傳漂變。
